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分离胶最新娱乐体验_10的分离胶能跑多大的蛋白(2024年12月深度解析)

内容来源：毛坦厂SEO所属栏目：话题更新日期：2024-12-01

分离胶

WB实验迷茫？看这篇就够！ 1⃣️ 如何避免胶跑得不漂亮？配胶：清洗玻璃板并检查是否漏气，避免胶凝固不均匀。倒胶时要充分混合并去除气泡。双蒸水或乙醇隔离时，缓慢加入，避免稀释分离胶。平衡：将配置好的胶放入点泳池，室温放置10分钟，待胶与电泳液温度一致再进行电泳。上样：拔出上样梳时要保持水平，避免上样孔倾斜。在样品两侧增加等体积的空白1x loading buffer孔，避免两侧样品条带扩宽。电泳：小电压能使胶的分子筛效应更好。电压越小，条带越漂亮。浓缩胶55V，分离胶75V电泳效果最佳，但时间长。 2⃣️ 电泳中常见现象： “︶” 条带呈笑脸状 “︵” 条带呈皱眉状条带拖尾纹理（纵向条纹）条带偏斜条带两边扩散 3⃣️ 如何降低WB背景？膜封闭不够：建议延长封闭时间，选择合适的封闭液。一抗稀释度不适宜：太高时选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育温度偏高：建议4℃过夜孵育。膜选择不当：NC膜的背景通常比PVDF膜低，但吸附力稍差。膜干燥或反复接触：实验过程中要保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。曝光时间过长：可减少曝光时间。 4⃣️ 如何减少杂带？目的蛋白存在多个修饰位点。目的蛋白有其他剪切本。样本处理过程中目的蛋白发生降解（最常见）。上样量过高：适当减少上样量。 5⃣️ 如何解决无信号或信号弱的问题？目标蛋白未提取出来：选用合适的裂解液。目标蛋白表达低：增加上样量。转移不完全或过转移：适当调整转膜的时间和电流。抗体不能识别测试种属的相关蛋白。一抗孵育时间不足：建议4℃结合过夜。二抗与一抗不匹配：选择针对一抗来源的种属的抗体。洗膜过度：缩短洗膜时间。 6⃣️ 其它现象：膜上多处出现黑点或黑斑：抗体与封闭试剂发生非特异性结合，或奶粉未充分溶解粘在膜上。反白（条带显白色）：目的蛋白含量太高或一抗浓度偏高。蛋白分子量偏低或偏高：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

WB实验全攻略：12个关键步骤详解 1. 𐟧𜠥ꌥ‡†备：确保所有用于提取蛋白的耗材和实验所需物品都已清洗干净。电泳玻璃板应放在置物架上隔开，以避免长期放置后黏连。 𐟒砦Š𝦏蛋白：在整个过程中，抽提蛋白的操作应在冰上进行。裂解液加入后，细胞会被破坏，细胞内的酶会被释放。不在冰上操作会导致蛋白降解。一旦开始抽提，应一次性操作至加入loading Buffer煮蛋白变性。变性后的蛋白不易降解，可以长期保存于-80℃。 𐟧꠩…胶：确保所有配胶所需的试剂都在有效期内。配制分离胶和浓缩胶时，需快速颠倒混合均匀。分离胶需要用去离子水压一下，以去除气泡和压平液面。分离胶凝固后再配浓缩胶，插入孔梳时要快，浓缩胶的凝固时间比分离胶短。为了避免浓缩胶插梳子时有气泡，可以先将浓缩胶倒满，斜着插入，记得梳子的正反一定要放对，否则玻璃板会碎。 𐟔堧…𗯼š蛋白加上loading Buffer后一定要充分混匀，再去煮使蛋白变性。 𐟓 上样：为了美观，需要定量上样。根据BSA与BCA试剂AB现配现用，静置5分钟后检测，计算出每个样本的浓度，定量上样量计算每孔上样量。 ⚡ 电泳：浓缩胶80v30分钟，分离胶120v55分钟（分离胶的时间根据样本跑到图中这条线停止）。 𐟓‘ 转膜：不要直接用手接触膜与滤纸，手上油脂会对其造成污染。佩戴干净手套全程尽量用镊子夹取，避免每一层之间的气泡，让胶与膜之间美美贴合。三层我用的是滤纸，如果有气泡产生一定要拿平的板赶一下气泡。 ❄️ 温度：转膜液现配现用，等需转膜用时再从4℃冰箱中拿出用。一般会在盒子里放上2冰袋，盖上盒子之后再用冰袋和冰块覆盖严实。 𐟕’ 浸泡：封闭液需要充分溶解，不充分溶解会导致曝光时背景脏或一片漆黑。浸泡时间要足够，我一般用震荡机溶解配好的封闭液，浸泡1小时（根据抗体情况可适当延长封闭时间）。膜先在甲醇中浸泡30秒，再在转膜液中浸泡一分钟。 𐟦 抗体孵育：一抗和二抗购买哪家的抗体可在官网找到稀释比例，一般范围值内的我选用最大的稀释倍数。一抗4℃孵育过夜，二抗孵育时间90分钟。 𐟚🠦𔗨†œ：洗膜一定要洗干净，一抗洗3次，每次10分钟；二抗洗4次，每次10分钟。 𐟓𘠦›光：发光液现配现用，时间过长会引起发光效果不好，背景脏或一片漆黑。发光液及拍摄都需避光。

WB实验全攻略：从准备到结果解读 𐟓š𐟔젥ꌥ‡†备试剂清单：分离胶、浓缩胶 SDS loading buffer（还原型，5x）电泳缓冲液电转缓冲液封闭液 TBST/PBST洗膜液抗体预染的 Protein Marker ECL化学发光试剂仪器设备： -20Ⰳ低温冰箱 BIO-RAD垂直板电泳转移装置或NOVEX iBlot蛋白快速电泳/干转印系统多用脱色摇床耗材与杂品：各种规格的吸头、离心管和加样器烧杯、量筒和平皿等玻璃器材 PVDF膜（0.22/0.45，根据分子量大小而定）滤纸、手套、搪瓷盘（>20x20cm）滚轮、计时器、吸水纸等 𐟧갟“ 试剂配制 TBST： TBS(10x) 100mL + 纯水 900mL + Tween20 5mL PBST： PBS(10x) 100mL + 纯水 900mL + Tween20 5mL 𐟖寸𐟓Š 实验步骤样品处理：提取蛋白质，加入SDS loading buffer，进行电泳。电泳：在BIO-RAD垂直板电泳转移装置或NOVEX iBlot蛋白快速电泳/干转印系统上进行。转膜：将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。封闭：用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点。抗体孵育：加入一抗和二抗，进行孵育。显色：使用ECL化学发光试剂进行显色，获取图像。结果解读：根据显色结果，分析蛋白质的表达情况。

WB配胶小技巧，轻松搞定电泳实验！大家好，我是实验室的小透明，不是大佬，但有些小经验愿意和大家分享。希望我的小心得能帮到你们，如果有不同意见，欢迎讨论，但别喷我哦，我可是有一颗钢化玻璃心的！洗板子的小窍门 𐟧𜊩斥…ˆ，板子一定要洗干净！不干净的板子可能会导致漏胶。我一般不用纸擦干板子，因为会有纸屑残留。洗干净后，我会把板子放在架子上的烘箱里烘干，这样板子会非常干净。如果板子不干净，滑动的时候会感觉有阻碍，干净的话就会像丝绸一样顺滑～防止漏胶的小技巧 𐟚犦œ‰些同学在加分离胶的时候发现胶漏了。为了防止漏胶，首先要确保短板和长板的底部没有大的坑坑洼洼。配胶下面的软垫尽量平滑，不要有坑坑洼洼，否则容易漏。短板和长板合起来后放在卡槽里，捏着卡槽的两端左右晃动，让玻璃板自然下坠，这样就不容易漏了。自从我从师兄那里学了这招，再也不用担心我的胶漏啦～分离胶的配制 𐟧ꊥˆ†离胶的浓度大家应该都知道，按照配方配没什么问题。每块分离胶的体积大概在6～7ml（建议多配一点，留在软管里，可以用来观察胶是否凝固了）。左右来回慢慢移动加胶，加到板子约2/3处，用无水乙醇压平（加无水乙醇后会有明显的分界线），等其凝固。浓缩胶的配制 𐟍‡ 分离胶凝固后把无水乙醇倒掉，等其挥发就可以加浓缩胶了。每块浓缩胶按照2～3ml配，上层胶凝固的很快，加入浓缩胶后应尽快插梳子（注意梳子是1.5还是1.0的），千万不要等它有点凝固的时候再插。如果一次性配很多块胶的话，我会加一个插一个。上样前的等待 ⏳ 浓缩胶凝固后最好不要立即上样，等半个小时后再上样效果更好～配胶的话，我感觉主要是熟能生巧，可能有一些没讲到的地方欢迎大家补充～今天做实验站了一整天，只有中午吃饭的时候用了半个小时，私信就明天回复吧，大家原谅我，我太累了。

WB制胶小技巧：让你轻松搞定蛋白电泳制备WB胶其实有很多选择，不同试剂盒和不同浓度的胶都会影响最终的结果。首先，你需要根据自己的样品数量选择合适的胶厚度，比如15孔还是10孔。为了确保每次加样品的总蛋白量一致，这样内参才会对齐。常见的胶厚度有0.75mm、1.0mm和1.5mm三种。如果你的上样量很大，比如超过10，建议不要选择0.75mm的胶，因为容易飘起来加不进去。关于胶浓度，这也是根据你要分离的蛋白大小来决定的。一般来说： 6%分离胶：适用于75-200kDa的蛋白 8%分离胶：适用于50-150kDa的蛋白 10%分离胶：适用于23-120kDa的蛋白 12%分离胶：适用于18-100kDa的蛋白 15%分离胶：适用于10-40kDa的蛋白这些胶浓度指的是PAGE（聚丙烯酰胺）的浓度，浓度越高，形成的网状结构越致密，越有利于小蛋白通过。打个比方，两个人跑的差不多快，10米他们几乎同时到终点，不好比较。那我们可以选择多设障碍（网状结构），就容易区分了，跑得快的更加明显。为什么要两层胶呢？下层胶叫做分离胶，起分离蛋白的作用。上层叫做浓缩胶，浓度是5%。这浓度几乎起不到分离作用，主要是让蛋白从5%突然到10%受到了阻碍，前面的人跑不动了，后面的人还不知道，就一直往前推，就会在两层胶中间被压缩，变成条带状，更有利于比较。所以浓缩胶不宜过长，一般1-2cm为佳。在操作过程中，一定要洗净玻璃板后，让长板短板下缘齐平，放到制胶架中测试是否漏水、5min。再倒掉，倒扣晾干或者是滤纸吸尽水，特别是底部才能开始制作。制胶离心管洗干净，有可能上一个人有残余胶，会影响你的胶。分离胶制备完成以后，可上下轻晃10次左右，尽快加入胶槽中，提前备好水/异丙醇压齐。分离胶高度到梳子下缘越1-2cm。等待时间看说明书或者是看制胶离心管的胶状态，一般15-25min。倒掉异丙醇略微晾干，就可以制备浓缩胶了。要点是尽量不要有气泡，打液体不要一下到底。制备完成以后，可以放入running buffer，或者是保鲜膜保存。可保存两三天。有人说4度冰箱，但是我老师更加推荐室温。希望这些小技巧能帮到你，让你的WB实验更加顺利！𐟒ꀀ

Western制胶全攻略：从原理到步骤 ### 原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳方法，采用非连续电泳系统，并引入变性剂SDS及还原剂，使蛋白样品最终仅依赖于分子量大小被分离。SDS-PAGE主要有三种效应：电荷效应：SDS与蛋白结合形成SDS-蛋白复合物，带有大量的负电荷，使电泳迁移率仅取决于蛋白的分子量。分子筛效应：凝胶的孔径大小不同，分子量大的蛋白通过的孔径小，分子量小的蛋白通过的孔径大。浓缩效应：浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH值不同，导致不连续性，从而产生浓缩效应。步骤夹玻璃板：将洗净晾干的玻璃板（前短后长）夹紧对齐放在制胶架上，根据上样量多少选择合适的厚度（1.5mm）。检漏：在左上角加入ddH2O，观察底部液面，然后倒掉ddH2O，用滤纸吸干备用。制备分离胶：根据分子量大小选择不同浓度的分离胶，如10%（分子量30-200kDa），12.5%/15%（分子量小于10kDa），7.5%（分子量大于200kDa）。将溶液、缓冲液和AP混合均匀，AP加入后要迅速混匀，否则容易凝固。加入分离胶：从左上角开始，1ml-1ml地加入分离胶，避免产生气泡，加至参考线上一点点（乙醇压后会下降少许）。注意溶液是过量的，不要全部注入，可以留少许在配胶杯中，以判断胶凝固状况。压胶：用异丙醇/无水乙醇，200ul-200ul左右移动加，避免冲散胶。倒胶：当下层胶凝固后（约15min），倒去上层无水乙醇。当无水乙醇和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固，或者看胶杯中残余的胶是否凝固。制备浓缩胶：将混合液搅拌均匀。加入浓缩胶：从左上角开始，加2ml浓缩胶。梳齿：垂直、平行、向下快速插入梳齿，避免产生气泡。待上层胶凝固后（约10~15min），拔去梳齿即可用于电泳。储存：上层及下层胶均可事先配好，可放于1X的电泳液中密封避光存放于4℃冰箱，至少可存放1周。

LC3A实验攻略𐟔劰Ÿ“Š 跑小分子蛋白的朋友们，来看看这个详细的实验流程吧！这里以LC3A（14/16kDa）为例，分享一些实用的技巧。 𐟔砥ˆ𖨃𖯼š 分离胶：15%的分离胶，适合1.5mm的板。一般配15ml。浓缩胶：5%的浓缩胶，配10ml。分离胶少加一点，浓缩胶多加一点，这样可以让条带更平整。 ⚡ 电泳：电压：80V（30min）后，改为100V，直到溴酚蓝距离底部1cm以上。 𐟔„ 转膜：膜：0.22的PVDF膜。电流：150mA，45min。之前试过200mA，但效果不如150mA好。 𐟥› 封闭：用5%的脱脂牛奶封闭2小时。 𐟧𔠤𘀦Š—和二抗：一抗过夜。回收抗体后，洗膜（每次10min，洗三次）。二抗。洗膜（每次15min，洗三次）。 𐟓𘠦˜𞥽𑯼š最后一步，显影即可。希望这些小技巧能帮助你更好地进行小分子蛋白实验！

WB分离胶和浓缩胶的完美配方指南 𐟓– 想要得到漂亮的WB条带？首先得有一块好的胶！这里为你整理了一份常用的WB分离胶和浓缩胶的配方，供你参考。𐟔 𐟒ᠥ𐏨𔴥㫯𜚨𐃦•𔤸™烯酰胺和水的比例可以轻松调整胶的浓度。例如，如果你需要9%的胶，以20ml为例，可以尝试加水8.5ml，丙烯酰胺6.1ml，其他成分保持不变。这样你就能得到8%-10%之间的胶了。 𐟓 配方总结：分离胶（以20ml为例）：水：14.5ml 丙烯酰胺：3.2ml 甲叉双丙烯酰胺：0.3ml 10%过硫酸铵：0.1ml TEMED：0.004ml 浓缩胶（以20ml为例）：水：12.5ml 丙烯酰胺：4.7ml 甲叉双丙烯酰胺：0.2ml 10%过硫酸铵：0.1ml TEMED：0.004ml 使用这些配方，你的WB条带一定会更加清晰、漂亮！𐟌Ÿ

SDS-PAGE电泳：揭秘分离秘诀大家好！今天我们来聊聊SDS-PAGE电泳，这是一种根据蛋白质分子量分离蛋白质的神奇方法。SDS-PAGE如何根据分子量分离蛋白质？𐟔슊在SDS-PAGE中，SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂。它和蛋白质结合后，会掩盖蛋白质本身的电荷差异，让蛋白质带上统一的负电荷，并展开其天然构象。这个过程有两个关键作用：破坏蛋白质结构：SDS能破坏蛋白质的二级和三级结构，使其成为线性分子。这样一来，不同蛋白质的迁移速度就不再受其结构影响。稳定结合比例：SDS与蛋白质的结合比例非常稳定，通常1.4g SDS结合1g蛋白质。这样每个蛋白质分子获得的负电荷与其质量成正比，电荷密度基本相同。因此，在SDS处理后，蛋白质在电场中的迁移速度只由其分子量决定。较小的蛋白质能更容易通过凝胶的孔隙，迁移得更快；较大的蛋白质受到更多阻力，迁移得较慢。由于SDS掩盖了蛋白质本身的电荷差异，SDS-PAGE可以精确地根据分子量进行分离，而不是依据蛋白质的形状或电荷。为什么使用两种不同的凝胶（浓缩胶和分离胶）？𐟧ꊊ在SDS-PAGE中，凝胶分为浓缩胶和分离胶，它们有不同的聚丙烯酰胺浓度和pH值。浓缩胶特点：浓缩胶的聚丙烯酰胺浓度较低，孔隙较大，pH值为6.8。作用：浓缩胶的主要作用是将样品中的蛋白质集中到一个非常窄的带中。在电泳过程中，所有蛋白质不论大小，都会在浓缩胶中高速迁移并聚集在界面处，使蛋白质在到达分离胶之前不会被分离。目的：使样品在进入分离胶之前排列整齐，确保所有蛋白质从同一条线上开始分离。分离胶特点：分离胶的聚丙烯酰胺浓度较高（通常为8%-15%），孔隙较小，pH值为8.8。作用：根据蛋白质的分子量对其进行真正的分离。由于分离胶的孔隙较小，较小的蛋白质能够更快通过凝胶，而较大的蛋白质则移动得较慢，最终根据大小分开形成条带。目的：分离胶根据分子量分离蛋白质。较高的聚丙烯酰胺浓度使得凝胶孔隙变小，增加了蛋白质分子移动的阻力，有效地分离大小相近的蛋白质。篇幅有限，更多细节请查看图片。

实习护士必看！一分钟掌握采血管顺序嘿，实习护士们！𐟑‹ 采血管这事儿，听起来简单，但细节决定成败哦！今天我就来帮你们整理了一份超实用的采血管使用指南，绝对让你一分钟内记住所有顺序和注意事项！不同采血管的用途红管：采血后不需要摇匀！主要用于临床血清生化、电解质、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标记物和免疫学检测。黄管：采血后要立即颠倒摇匀8次！包含促凝剂和分离胶，适用于血清生化、电解质、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标记物、PCR和免疫学检测。蓝管：采血后也要摇匀8次！抗凝管，全血2ml，添加剂是枸缘酸钠，抗凝剂与血液比例1:9。紫管：同样需要摇匀8次！抗凝管，全血2ml，添加剂是EDTA-K2，主要用于血常规、血涂片和血氨检测。绿管：采血后摇匀8次！抗凝管，全血4-5ml，添加剂是肝素锂抗凝，适用于血流变检测。黑管：采血后摇匀8次！抗凝管，全血4-5ml，添加剂是枸橡酸钠抗凝，抗凝剂与血液比例1:4。灰管：采血后摇匀8次！抗凝管，添加剂是草酸钾和氯化钠。浅绿色管：采血后摇匀8次！抗凝管，血浆4-5ml，添加剂是肝素锂和分离胶。采血管顺序口诀血培养+蓝+黑-红-黄-绿-紫-灰一个男(蓝)人很黑(黑)，过红绿灯要听指(紫)挥(灰) 拔针按压注意事项伸直手臂，用棉签按压穿刺点3-5分钟。采血后多休息。 24小时内避免洗澡。观察身体反应。希望这份指南能帮到你们，让采血管这件事儿变得简单又高效！𐟒ꠥŠ 油，实习护士们！𐟒ꀀ

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