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分离胶最新娱乐体验_分离胶采血管(2024年11月深度解析)

内容来源：毛坦厂SEO所属栏目：话题更新日期：2024-11-27

分离胶

WB制胶小技巧：让你轻松搞定蛋白电泳制备WB胶其实有很多选择，不同试剂盒和不同浓度的胶都会影响最终的结果。首先，你需要根据自己的样品数量选择合适的胶厚度，比如15孔还是10孔。为了确保每次加样品的总蛋白量一致，这样内参才会对齐。常见的胶厚度有0.75mm、1.0mm和1.5mm三种。如果你的上样量很大，比如超过10，建议不要选择0.75mm的胶，因为容易飘起来加不进去。关于胶浓度，这也是根据你要分离的蛋白大小来决定的。一般来说： 6%分离胶：适用于75-200kDa的蛋白 8%分离胶：适用于50-150kDa的蛋白 10%分离胶：适用于23-120kDa的蛋白 12%分离胶：适用于18-100kDa的蛋白 15%分离胶：适用于10-40kDa的蛋白这些胶浓度指的是PAGE（聚丙烯酰胺）的浓度，浓度越高，形成的网状结构越致密，越有利于小蛋白通过。打个比方，两个人跑的差不多快，10米他们几乎同时到终点，不好比较。那我们可以选择多设障碍（网状结构），就容易区分了，跑得快的更加明显。为什么要两层胶呢？下层胶叫做分离胶，起分离蛋白的作用。上层叫做浓缩胶，浓度是5%。这浓度几乎起不到分离作用，主要是让蛋白从5%突然到10%受到了阻碍，前面的人跑不动了，后面的人还不知道，就一直往前推，就会在两层胶中间被压缩，变成条带状，更有利于比较。所以浓缩胶不宜过长，一般1-2cm为佳。在操作过程中，一定要洗净玻璃板后，让长板短板下缘齐平，放到制胶架中测试是否漏水、5min。再倒掉，倒扣晾干或者是滤纸吸尽水，特别是底部才能开始制作。制胶离心管洗干净，有可能上一个人有残余胶，会影响你的胶。分离胶制备完成以后，可上下轻晃10次左右，尽快加入胶槽中，提前备好水/异丙醇压齐。分离胶高度到梳子下缘越1-2cm。等待时间看说明书或者是看制胶离心管的胶状态，一般15-25min。倒掉异丙醇略微晾干，就可以制备浓缩胶了。要点是尽量不要有气泡，打液体不要一下到底。制备完成以后，可以放入running buffer，或者是保鲜膜保存。可保存两三天。有人说4度冰箱，但是我老师更加推荐室温。希望这些小技巧能帮到你，让你的WB实验更加顺利！𐟒ꀀ

WB实验配胶小贴士，轻松搞定！配胶是WB实验中至关重要的一步，想要成功配胶，不手忙脚乱？以下是一些实用的小贴士： 𐟧頩斥…ˆ，确定需要几孔的梳子，以及要跑的蛋白分子量多大。根据分子量选择不同浓度的分离胶。如果你使用的是普利莱的配胶试剂盒，这将变得非常简单，因为一个浓度可以覆盖10-300kd，无需再选择不同浓度。 𐟤— 配胶前要做好充分准备： 1⃣️ 用流水冲洗玻璃板，可以使用洗洁精彻底清洗。 2⃣️ 清洗后，用纯水再次冲洗，然后用吸水纸擦干。 3⃣️ 将两块玻璃板对齐，放在制胶架上，检查是否压紧按实。如果有缝隙，会漏胶。 4⃣️ 检查所需试剂是否足够，不要在配胶过程中中途找试剂，特别是乙醇，容易忘记。 5⃣️ 使用前将AP涡旋混匀（一般从-20℃取出，化冻后需混匀）。如果你使用的是普利莱的配胶试剂盒，这一步可以省略，因为它不需要单独加AP，也不需要单独加Temed（味道刺鼻，使用时需憋气）。 6⃣️ 准备好所需的移液枪和枪头，避免配胶过程中发现缺少枪头。同时，找到配对的梳子。 7⃣️ 将所有试剂加入后，涡旋混匀，然后灌胶。 8⃣️ 加入分离胶后，立即用纯水或乙醇压平液平面。实际上，用纯水压平也是可以的，不一定非要用乙醇。 9⃣️ 剩余的试剂可以先保留，用于观察。 𐟑€ 通过这些步骤，你可以轻松地完成WB实验的配胶部分，提高实验效率和成功率，同时获得规整的条带。实验习惯可能因人而异，但这些小贴士可以帮助你更好地准备和进行实验。

𐟓 蛋白质印迹技术全解析，复试必备！蛋白质印迹（Western blotting），也称为免疫印迹，是一种利用抗原抗体特异性结合来半定量检测样品中特定蛋白的方法。𐟔 𐟌ˆ 核心技术：SDS-PAGE SDS-PAGE，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过将蛋白质与SDS结合，根据蛋白质大小而非其他物理特征来分离蛋白质。 𐟔젥ˆ†离原理： SDS（十二烷基硫酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白质结合，形成密度相同的短棒状复合物。 SDS与蛋白质的结合按质量成比例（1.4g SDS /g蛋白质），确保蛋白质完全结合。 𐟚€ 分离步骤： 1️⃣ 提取组织中的总蛋白。 2️⃣ 进行SDS-PAGE电泳。 3️⃣ 转膜。 4️⃣ 免疫反应，包括一抗和二抗的结合。 5️⃣ 化学发光、显影和定影。 𐟔‘ 关键步骤解析：浓缩胶和分离胶：用于蛋白质的分离。转膜：将凝胶上的蛋白质转移到膜上。封闭：阻止非特异性结合。显色：检测一抗或二抗的结合。 𐟓š 通过这些步骤，我们可以深入了解蛋白质在细胞或组织中的表达情况，为生物研究和医学诊断提供有力支持。𐟒က

wb跑电泳正常样子小分子蛋白，顾名思义，就是在WB（Western Blot）检测中小于20kDa的那些小家伙们。由于它们分子量小，容易降解，还带电量少，吸附能力自然也就弱了。所以，用常规的WB步骤来检测小分子蛋白，结果常常不稳定，时有时无，甚至可能出现转膜失败、蛋白弥散等情况。为了搞定这些小分子蛋白，我们需要对实验步骤进行一些优化，提高结果的准确性。上样量的选择 𐟓 通常来说，Western Blot每孔上样量是30-50。但如果你在检测小分子蛋白，上样量建议增加到50-100。这样可以减少蛋白在电泳时的弥散情况。电泳技巧 𐟚€ 配置SDS-PAGE胶时，选择高浓度的12%-15%分离胶进行电泳。同时，加大浓缩胶的比例，让浓缩胶与分离胶的比例约为4:6，甚至可以5:5。这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分浓缩，减少后续分离时的弥散程度。电泳时，先用80V电压压缩40分钟，电泳至两种胶的界面。然后将电压调整到100V，在12%-15%的分离胶中进行电泳，跑到分离胶一半的位置。一般10kDa的marker能分开就可以了。这样可以避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。转膜和封闭 𐟧ꊊ小分子蛋白由于其分子量小、易降解、吸附能力弱，所以在转膜时一般使用0.22的PVDF膜。转膜时不要在转膜液中加入SDS，防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合。可以将甲醇的浓度提升至30%，增强蛋白与膜的结合性。实例详解：IL-8蛋白检测 𐟌쯸 IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一种促炎性细胞因子，大小约为11kDa，通常由许多细胞产生，包括巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。IL-8在免疫应答中发挥关键作用，包括诱导中性粒细胞等免疫细胞向炎症部位迁移，并刺激这些细胞的激活。在实际操作中，我们可以通过优化上述实验步骤来更准确地检测IL-8蛋白。希望这些技巧能帮助你在WB实验中取得更好的结果！

Abmart抗体真香！实验成功秘诀大公开 Abmart的抗体真的太好用啦！比国内很多抗体都有优势，效果明显，几乎没有杂带，真是国货之光。特别推荐他们的TLR4抗体，简直是我的实验神器。在使用抗体之前，我仔细阅读了说明书，了解了抗体的储存条件和稀释比例。显影后发现条带清晰，背景干净。我的实验步骤如下：提取细胞总蛋白：在冰上进行，确保蛋白的活性。加入loading buffer：收集完蛋白后，加入loading buffer，100度煮10分钟，让蛋白充分变性。 SDS-PAGE电泳：浓缩胶80V，分离胶120V，溴酚蓝跑到底，确保蛋白分离完全。转膜：这个过程特别重要，要注意排出气泡，PVDF膜在甲醇中激活，并且全程在冰浴中进行转膜。电转液要提前放在冰箱中预冷。电转条件为100V恒压，60分钟。封闭：提前一个小时配牛奶，室温封闭一个小时，确保背景干净。感谢Abmart提供这么好的抗体，让我的实验如此顺利！𐟒갟’

SDS-PAGE电泳原理与IEF技术详解 𐟌📄S-PAGE电泳原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种广泛用于分离大分子的技术，包括DNA、RNA和蛋白质。通过施加电场，带电离子在电泳过程中发生迁移。分子的迁移率取决于其净电荷和通过溶液的电阻。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，其在较广的pH范围内带有净负电荷。多肽链与SDS结合，其结合量与其相对分子质量成比例，破坏蛋白质的复杂结构。在SDS-PAGE中，凝胶被分为浓缩胶和分离胶两层。浓缩胶位于底部，较大，而分离胶位于顶部，较窄。电泳缓冲液由甘氨酸制成，pH值为8.3。浓缩胶的pH值为6.8，而分离胶的pH值为8.8。电流由带负电荷的分子携带，向同一个方向迁移。在pH 8.3时，约有10%的甘氨酸分子带负电荷，因此电流主要由堆积缓冲液中的Cl-离子携带。Cl-离子在蛋白质之前朝堆积凝胶底部堆积，使得由SDS包裹的蛋白质分子被夹在甘氨酸分子和Cl-离子之间，被浓缩成比最初加载的体积小得多的条带。随着电流作用迁移，蛋白质迁移到分离胶中。此时，pH为8.8的分离凝胶缓冲液中的甘氨酸成为带负电荷的分子，能够非常快速的迁移，几乎与Cl-离子保持一致，而蛋白质紧随其后。蛋白质经由Cl-和甘氨酸阴离子的移动轨迹进入分离凝胶而携带电流。蛋白质变成一种具有类似流体动力学性质的杆状带负电荷高分子，其迁移率仅取决于其分子质量。 𐟌🧭‰电聚焦IEF分析等电聚焦（IEF）是一种基于蛋白质等电点（pI）分离蛋白质的电泳技术。当pI=pH时，蛋白质净电荷为0，因此蛋白质不会在电场中迁移。在IEF中，蛋白质的分离是在含有两性电解质混合物的聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中进行的，两性电解质在电场中迁移并在凝胶中形成pH梯度。蛋白分子被集中在一个具有pH梯度的介质中，通过介质的电流将产生带正电荷的氧化极和带负电荷的还原极。带电的蛋白质分子会向与其有相反电荷的一极运动，直到与周围pH值与其等电点相同时带电分子才停止在凝胶中运动，即蛋白质净电荷为0时。于是，具有相同等电点的蛋白质集中在pH固定的条带中。每种蛋白质都位于pH梯度中与其pI相对应的位置。

western blot详细步骤 𐟒禸…洗玻璃板并固定，长板后置短板前。 𐟓将板子放置于制胶架上，加入蒸馏水测试泄漏，静置15分钟。 𐟔쥐𘦰𔧺𘦓楹𒥐Ž，加入分离胶，液封，37Ⰳ恒温30分钟。 𐟓–按比例配置浓缩胶，混匀后灌入胶板。 𐟪㦏’入梳子，再放置37Ⰳ恒温50分钟。 𐟎‰完成制胶，准备进行Western Blot实验吧！𐟌Ÿ

EMSA实验揭秘：凝胶迁移 𐟌 凝胶电泳：在开始EMSA实验之前，首先需要制备6.5%的凝胶。与常规的凝胶电泳不同，EMSA实验无需分离胶和浓缩胶。在加入10%的过硫酸铵（AP）之前，确保凝胶在室温下静置10分钟以去除气泡。然后，加入10%的AP并混匀，灌胶。 𐟔砩℧”𕦳𓯼š 在加样电泳之前，进行预电泳以去除残余的杂质。使用预冷的0.5㗔BE缓冲液，以100V恒压电泳30-60分钟。预电泳过程中，用移液器反复冲洗上样孔3-5次。 𐟧ꠥˆ𖦠𗯼š 根据表格中的mix配方，配置反应体系。由于样品数量较多，建议使用mix混合液以减少加样误差并节省操作时间。将配置好的反应体系分装到标记好的PCR管中，依次加入双蒸水、核蛋白和生物素标记的探针，室温孵育10分钟。 𐟚€ 上样：孵育结束后，加入5的Loading Buffer，轻轻吹打混匀，准备上样。在电泳结束前，配置好0.5㗔BE电转移缓冲液并放置于冰箱预冷。将样品加载到样品孔中，以100V恒压低温条件下电泳45分钟，至指示剂到达胶的2/3处。 𐟌 转膜：电泳结束后，小心地从电泳装置中移走一片玻璃片，去掉样品孔的凝胶。将凝胶与另一片玻璃一起移入装有0.5㗔BE的盒子中，让凝胶与玻璃板分离并漂浮在缓冲液中。 𐟔砦𕸦𓡤𘎨𝬥𐯼š 将尼龙膜、同胶一样大小的厚滤纸及海绵垫在0.5㗔BE中浸泡10分钟。在转印夹的黑色面板中心依次放置海绵垫、至少3层印迹滤纸、转印膜、胶和至少3层滤纸。用玻璃试管在滤纸上轻轻滚动，以驱赶气泡。 𐟔頤𚤨”：将装配好的电转移夹放入电转移槽中，在0.5㗔BE中以100V恒压转45分钟。转膜结束后，将膜放置于干净滤纸上，膜正面朝上，放置在紫外灯下10厘米处，交联20分钟，交联前保持膜湿润。

𐟔젥𐏥ˆ†子蛋白跑WB的技巧与注意事项在实验室工作中，小分子蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax以及自噬相关蛋白LC3B等非常常见。以下是跑WB时需要注意的几个关键点： 1️⃣ 配胶：小分子蛋白的分离胶浓度一般为12%-15%，这样可以使条带更加清晰。在倒胶时，浓缩胶的比例可以适当增加到4：6，有助于充分浓缩蛋白，减少电泳过程中的弥散。 2️⃣ 上样：建议增加1倍的上样量，以防蛋白弥散过多。选择适用于小分子蛋白的marker，这样在敷抗体时可以更清楚地裁膜。电泳开始前，可以用1⴬oading buffer补齐未点样的胶孔，防止两边不齐跑成“八”字。 3️⃣ 电泳：在浓缩胶部分设置恒压70V、30分钟左右，使蛋白浓缩到一条线上后，调大电压至110V，直至所需蛋白区域全部分开。避免长时间低电压跑胶，以防蛋白弥散过多。同时，整个电泳过程中要注意降温。 4️⃣ 转膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此转膜时选择0.22的PVDF膜。常规0.45膜容易穿透，剩余条件同正常蛋白一般可以满足条件。 5️⃣ 封闭：使用快速封闭液或脱脂牛奶按正常条件封闭即可。裁膜时根据marker上下留出足够多的空间。 6️⃣ 一抗孵育：在保证上述条件的基础上，一抗是出好结果的关键一步。若没有前期实验经验，一抗的稀释比一般按照说明书配置。若有前期实验经验，可适当调整比例。一抗浓度过高可能导致显影阶段出现杂带，过低则可能看不到条带。使用1ⴔBST缓冲液稀释，4℃孵育过夜。 7️⃣ 后续步骤：二抗比例及孵育时间、显影按常规操作即可。若抗体不好用或蛋白难出结果，可适当延长洗膜时间及次数。 𐟓Œ 注意事项：转膜时，若蛋白分子量过小，可适当提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。跑小分子蛋白时marker尽量不跑到一张膜上，对于常见内参GAPDH、Actin及Tubulin等来说，分离胶浓度大上述蛋白区域一般分不开或分离不完整，易导致内参不齐。

Western Blot实验全流程详解 Western Blot是一种常用的蛋白质检测方法，以下是详细的实验步骤：取材 𐟧슩斥…ˆ，根据实验需求取材。提取蛋白质 𐟒ꊥ𐆥–出的材料进行蛋白质提取。 BCA法测蛋白质浓度 𐟓 使用BCA法测定蛋白质浓度。制备蛋白质上样样本 𐟓‹ 将提取的蛋白质制备成上样样本。制备PAGE胶 𐟧ꊦŒ‰照说明书依次加入超纯水、30%丙烯酰胺、分离胶缓冲液、10%过硫酸铵和TEMED，然后加入分离胶，用无水乙醇液封。室温静置30分钟，待分离胶完全凝固后倒掉无水乙醇。接着配制浓缩胶，加入浓缩胶缓冲液、30%丙烯酰胺、10%过硫酸铵和TEMED，插入制胶梳，室温静置30分钟。PAGE胶一般现配现用，如果不用，可装入封口袋中加入少许超纯水保持湿润，放在4℃冰箱中保存。 SDS-PAGE电泳 ⚡ 将PAGE胶用电泳夹固定好，倒入新鲜配制的电泳缓冲液，依次将蛋白上样样本加入到上样孔中，在样本两边加入蛋白marker，最后进行电泳，电泳条件是200V，30分钟，当澳酚蓝指示带到达胶底部时电泳完成。转膜 𐟌 电泳完毕后，用双蒸水洗涤PAGE胶，去除残留的电泳缓冲液。将剪好的PVDF膜放入甲醇中激活，将膜、海绵、滤纸一起放入转膜液中，用翘板撬开玻璃板，切除胶多余的部分，按照顺序将海绵、滤纸、胶、膜放在电泳夹里面，合起电泳夹。将夹子放入转印电极中，倒入转膜缓冲液，进行转膜，转膜条件是200mA，120分钟。注意：电泳仪放在冰盒里，因为电流过大会发热，胶可能会变形。封闭 𐟔’ 将膜放入TBST中洗涤3次，每次5分钟。洗涤完毕后，加入5%脱脂牛奶进行封闭，将抗体孵育盒放到摇床上，室温封闭1小时。一抗孵育 𐟐›ž收封闭液，将提前配制好的一抗溶液加入到抗体孵育盒中，将抗体孵育盒放到摇床上，4℃孵育过夜。二抗孵育 𐟐‘ 将一抗回收后，用TBST洗涤3次，每次5分钟。洗涤完毕后将二抗溶液加入到抗体孵育盒中，将抗体孵育盒放到摇床上，室温孵育1小时。孵育完毕后，回收二抗溶液，用TBST洗涤3次，每次5分钟。化学发光 𐟌Ÿ 进行化学发光检测。通过以上步骤，你可以完成Western Blot实验，检测蛋白质的表达情况。

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